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【手工實驗步驟】

以下實驗步驟提供EmerTher氨基磁珠的一般操作流程，具體實驗中磁珠的用量可以適當調整。針對不同的用途，建議對偶合的條件（蛋白質濃度、偶聯溶液、pH和孵育時

間）進行相應的優化。EmerTher氨基磁珠的活化反應條件不只限于本文所述，其他常用活化條件也是適用的。

A. 磁珠活化

1. 使用前顛倒混勻磁珠；

2. 取50μl磁珠 (1mg) 放入微量離心管；

3. 將離心管放入磁力架, 吸附磁珠并去上清；

4. 用1ml偶聯溶液洗滌磁珠，洗滌3次，每次洗滌完后吸附磁珠并去上清；

5. 將磁珠重懸于400μl 5% 戊二醛溶液，振蕩混勻；

6. 溫和旋轉條件下，在室溫反應3小時；

7. 吸附磁珠，棄上清；

8. 加入1ml偶聯溶液洗滌磁珠除去未反應的戊二醛，洗滌3次，每次洗滌完后吸附磁珠并去上清。

B. 蛋白偶合

1. 在離心管中加入200μl蛋白溶液，重懸活化好的磁珠；將離心管放置于旋轉混合儀，在室溫下或4°C溫和混合24小時；

2. 通過磁場分離磁珠，棄上清；

3. 加入800μl封閉溶液，振蕩混勻，在室溫下溫和混勻30min；

4. 吸附磁場，棄上清；

5. 加入1ml洗滌緩沖液洗滌磁珠3次，每次洗滌完后吸附磁珠并去上清；

6. 將磁珠重懸于1ml洗滌緩沖液或其它合適的緩沖液，偶聯蛋白后的磁珠儲存于2-8°C。

C． 注意事項

1. 以上的操作流程適合于將含氨基的配體偶聯在 EmerTher 氨基磁珠上。EmerTher氨基磁珠也可以與含羧基的配體偶聯。一般常規的氨基磁珠反應也都適用。

2. 偶聯溶液的離子強度對提高偶合效率很重要。一般來說，偶聯溶液的離子強度越低越好，而且偶聯溶液不應含任何氨基 (如Tris) 或羧基（如乙酸酯和檸檬酸），但洗滌緩

沖液或保存液可以含氨基或羧基。

3. 反應的蛋白濃度需要優化，蛋白濃度太低會導致磁珠交聯。對于昂貴的蛋白，如果蛋白濃度太低，可以加入別的蛋白（如BSA）占據剩余的反應活性位點。

4. 含戊二醛或吡啶的溶液具有揮發性和毒性，請在化學通風櫥里進行相應操作。

5. 磁珠使用和保存過程中應避免冷凍、干燥和高速離心等操作，這些操作會降低磁珠結合能力。

1、偶聯溶液的離子強度對偶合效率是否影響？
答：一般來說，偶聯溶液的離子強度越低越好，而且偶聯溶液不應含任何氨基 (如Tris) 或羧基（如乙酸酯和檸檬酸），但洗滌緩沖液或保存液可以含氨基或羧基。

2、反應的蛋白濃度是否需要優化？
答：蛋白濃度太低會導致磁珠交聯。對于昂貴的蛋白，如果蛋白濃度太低，可以加入別的蛋白（如BSA）占據剩余的反應活性位點。