羧基化磁珠是包被有羧酸官能團的超順磁性納米微球,可以在被活化后(例如使用EDC和磺基-NHS活化),與核酸、蛋白質、抗體或其它分子上的伯胺進行偶聯反應以形成穩定的酰胺鍵。偶聯后的磁珠可通過磁場吸附從溶液中分離出來,直接用于下游的酶反應或大分子的免疫純化分離等試驗。
作用原理(示意圖):
略。
目錄號 | 規格 | 適用機型 |
---|---|---|
FE03001 | 20mg/ml,1ml | 略 |
FE03002 | 20mg/ml,5ml | 略 |
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以下實驗步驟提供EmerTher羧基磁珠的一般操作流程。具體實驗中磁珠的用量可以適當調整。 針對不同的用途,建議對偶合的條件(蛋白質濃度、偶聯緩沖液、 pH和孵育
時間)進行相應的優化。EmerTher羧基磁珠的活化反應條件不只限于本文所述,其他常用活化條件也是適用的。
EDC/Sulfo-NHS活化和偶聯步驟:
Step 1.活化
1. 使用前顛倒混勻磁珠;
2. 取50μl磁珠 (1 mg) 到微量離心管;
3. 將離心管放入磁力架,吸附磁珠并去上清;
4. 用1ml活化緩沖液洗滌磁珠,洗滌3次后,用1ml活化緩沖液重懸磁珠;
5. 同時加入5mg EDC和5mg sulfo-NHS,振蕩混勻;
6. 室溫下反應15min;
7. 磁場吸附,棄液體;
8. 加入1ml活化緩沖液洗滌磁珠,吸附磁珠并去上清;
9. 用5ml活化緩沖液重懸磁珠;
Step 2. 偶聯
1. 偶聯蛋白溶液配制:蛋白溶解在5ml偶聯緩沖液中. 蛋白濃度一般1-10 mg/ml;
2. 在5ml磁珠懸液中加入5ml蛋白溶液,置于旋轉混合儀室溫下反應2-4hr,或4°C過夜;
3. 磁場分離磁珠,移除含蛋白上清液;
4. 加入10ml封閉液,重懸磁珠,置于旋轉混合儀室溫下混合2-4hr,或4°C過夜;
5. 通過磁場分離磁珠,去上清;
6. 用1ml封閉緩沖液洗滌偶聯蛋白的磁珠兩次,每次15min,吸附磁珠并去上清;
7. 用1ml封閉緩沖液或合適的緩沖液懸浮磁珠;
8. 偶聯后的磁珠于2-8°C儲存。
1、蛋白不溶于結合緩沖液?
答:蛋白可能為疏水性的,溶解蛋白之前可在結合緩沖液中加入適量DMSO(最多20%)。
2、結合效率低?
答:含有伯胺的緩沖液沒有完全去除。請在蛋白結合之前對蛋白樣品去鹽或透析以完全去除伯胺(如Tris和glycine)。