Protein A/G抗體純化磁珠是由超順磁性顆粒與protein A及 protein G共價偶聯而成。Protein A/G對多個物種IgG的不變區域（Fc）具有很高親和力，包括人類，狗和兔等。醫脈賽Protein A/G抗體純化磁珠具有快速磁響應性，高蛋白結合能力和低非特異性結合，可快速有效地從血清、腹水或細胞培養液等生物樣品中分離和純化免疫球蛋白，也可通過抗原抗體結合從生物樣品中免疫沉淀靶蛋白。本產品可再生及再生后使用，用于高效抗體制備。
操作流程（示意圖）：
蛋白A/G（Protein A/G）抗體親和磁珠從人血清樣本中純化抗體實例見下：
| 目錄號 | 規格 | 適用機型 |
|---|---|---|
| AE03001 | 20mg/ml，1ml | 略 |
| AE03002 | 20mg/ml，5ml | 略 |
【手工實驗步驟】
本實驗步驟提供一般操作流程，實驗具體條件可根據特定應用由用戶進行優化，包括培養條件（濃度，時間和緩沖液）以及所需磁珠用量。
A. 抗體的純化
以下通用的實驗方案適用于從血清，腹水，細胞培養液或其它生物樣品中純化抗體。
1. 振蕩懸浮磁珠，吸取磁珠(如25μl，0.5mg)加入2ml滅菌離心管中，磁場吸附，棄去上清液；
2. 加500μl結合/洗滌緩沖液，洗滌磁珠，磁場吸附，棄去上清液；
3. 重復步驟2洗滌磁珠，磁場吸附，棄去上清液；
4. 將磁珠重懸于200μl結合/洗滌緩沖液，加入50μl血清（血清加入前可能需要稀釋，以減少非特異性結合；稀釋的程度可根據特定的應用進行優化），輕柔振蕩懸浮，在室
溫下孵育15分鐘；
5. 磁場吸附，棄去上清液；
6. 加入結合/洗滌緩沖液（每次1000μl）洗滌3次，磁場吸附，棄去上清液；在最后一個洗滌過程中將磁珠轉移到一個干凈的試管，以避免粘在管壁上的蛋白質在下一步被一
起洗脫下來；
7. 加入50μl洗脫液，輕微振蕩懸浮，室溫洗脫10分鐘；
8. 磁場吸附，將洗脫液轉移到一個新試管中。加入5μl中和緩沖液以中和pH值。純化的抗體可直接使用或貯存于2-8℃。
B. 靶抗原的免疫沉淀
以下通用的實驗方案適用于從細胞裂解物等生物樣品中免疫沉淀靶抗原。建議每200μl含200?500μg總蛋白的細胞粗裂解物使用25μl 磁珠。如果無需裂解細胞可跳過第一
步。免疫沉淀可選擇直接法或間接法。
1. 裂解細胞
1.1. 用PBS洗滌附在培養皿上的細胞；
1.2. 加入500μl預冷卻的細胞裂解緩沖液以裂解細胞；
1.3. 從培養皿刮下細胞，超聲破碎5秒，重復4次，在4℃ 1000g離心5分鐘，得到的上清液為細胞粗提液；
1.4. 檢測總蛋白含量，使用細胞裂解緩沖液調整總蛋白濃度至約1mg/ml。
2. 免疫沉淀
2.1 直接法
a) 振蕩懸浮磁珠，吸取25μl磁珠加入1.5ml滅菌離心管中，磁場吸附，棄去上清液；
b) 加500μl結合/洗滌緩沖液，洗滌磁珠，磁場吸附，棄去上清液；
c) 重復步驟b洗滌磁珠，磁場吸附，棄去上清液；
d) 將1-5μg抗體溶于200μl結合/洗滌緩沖液后，加入到含磁珠的離心管，并在室溫下輕搖孵育10分鐘，以使抗體和蛋白A/G磁珠結合，抗體的用量應根據該抗體的特性進行
優化；
e) 磁場分離，棄上清液；
f) 加入結合/洗滌緩沖液（每次1000μl）洗滌磁珠2次，磁場吸附，棄去上清液；
g) 加入200μl含靶抗原的細胞粗提液，在4℃下懸浮孵育1小時，孵育條件可根據特定的抗體-抗原反應進行優化；磁場吸附，棄去上清液；
h) 加入結合/洗滌緩沖液（每次1000μl）洗滌磁珠2次，磁場吸附，棄去上清液。
2.2 間接法
a) 加入1-5μg抗體至200μl細胞粗提液，4℃下輕搖孵育1hr，以使抗體和細胞粗提液中的靶抗原結合，孵育條件可根據特定的抗體-抗原反應進行優化；
b) 震蕩懸浮磁珠，吸取25μl磁珠加入1.5ml滅菌離心管中，磁場吸附，棄去上清液；
c) 加500μl結合/洗滌緩沖液，洗滌磁珠，磁場吸附，棄去上清液；
d) 重復步驟c洗滌磁珠，磁場吸附，棄去上清液；
e) 將抗體和細胞粗提液孵育后的樣品（見步驟a）加入到含磁珠的離心管，并在室溫下輕搖孵育10分鐘，抗原-抗體復合物與磁珠結合；磁場分離，棄上清液；
f) 加入結合/洗滌緩沖液（每次1000μl）洗滌磁珠2次，磁場吸附，棄去上清液。
3. 洗脫靶抗原
3.1 非變性洗脫：加入50μl洗脫液重懸磁珠，輕微振蕩懸浮，室溫洗脫5分鐘；磁場吸附，將含靶抗原的洗脫液轉移到一個新試管中，加入5μl中和緩沖液以中和pH值。
3.2 變性洗脫：加入30μl SDS-PAGE reducing sample buffer重懸磁珠，90℃變性蛋白5min。磁場分離，取含靶抗原的上清液進行SDS-PAGE凝膠電泳等檢測。
C. 再生
在非變性洗脫條件下，本產品可反復使用。在多次反復使用后可能因雜質吸附導致結合量下降，本產品耐受pH13以下溶液，建議磁珠使用5次及以上、當抗體載量下降后進
行堿處理，以去除非共價結合的蛋白，提高磁珠對抗體的吸附量。
1. 將1mg磁珠置于0.5ml 0.05M NaOH溶液中15min；
2. 磁場分離，棄上清液；
3. 加入0.5ml結合/洗滌緩沖液洗滌磁珠；
4. 磁場分離，棄上清液，將磁珠重懸于結合/洗滌緩沖液，2-8℃保存。
A. 蛋白回收率低，會有什么原因？
1. 蛋白可能會降解?？稍诩毎呀庖褐刑砑拥鞍酌敢种苿?；
2. 磁珠用量不足。增加磁珠的用量；
3. 樣品中蛋白含量低。增加樣品的濃度或體積；或使用低分子量過濾膜（例如截留分子量為3500 Dalton的過濾膜），以減少起始樣品體積和增加蛋白的濃度；
4. 孵育時間不足。培養時間將取決于靶蛋白的濃度和抗原-抗體的親和力；
5. 不正確的洗脫體積。洗脫液體積通常在100-200μl。如果蛋白濃度低時，可由較小體積洗脫。建議重復洗脫1-2次，最后合并洗脫液。
B. 在非變性洗脫中，使用低pH值洗脫液，蛋白沒有完全洗脫下來，怎么解決？
1. 洗脫條件過于溫和。增加洗脫所用的孵育時間；或增加洗脫液的體積。
2. 檢查洗脫液的pH值，可使用pH值2.7-3.5的洗脫液洗脫。
C. 在洗脫樣品中發現非特異性蛋白質，怎么解決？
1. 非特異性蛋白質結合到磁珠上。在結合/洗滌緩沖液中加入NaCl (50mM至350mM），減少非特異結合。
2. 也可在結合/洗滌緩沖液中添加洗滌劑，如0.01-0.1％的Tween-20，以減少非特異性結合。
3. 增加洗滌的步驟或洗滌緩沖液的體積。
4. 稀釋樣品。
