磁珠法體液DNA提取試劑盒
分類：體液DNA提取目錄：DE01
產品特性：
| 高通量：40min即可完成提取過程 |
| 環境安全：不含有害有機溶劑 |
| 抗凝劑普適：可用于各種抗凝劑 |
| 自動化適用：提供預裝板適配核酸自動提取儀 |
操作流程（示意圖例）：
磁珠法基因組DNA提取試劑盒在胃液樣本提取幽門螺桿菌核酸的應用實例見下。
1.標本
快速尿素酶陽性（RUT+）胃液標本35例
2.試劑
①EmerTher磁珠法基因組DNA提取試劑盒；②QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)。
3.標本核酸提取方法
胃液預處理
取1ml的胃液加入1.5ml的離心管中，加入等量的Tris緩沖液（0.67M，pH7.4），振蕩均勻，室溫放置2h。13000rpm離心5min，棄上清留沉淀。
EmerTher磁珠法基因組DNA提取試劑盒：
? 經預處理的胃液沉淀中加入700μl 裂解吸附液，混和均勻，裂解細胞6min；
? 加入30μl磁珠懸浮液，振蕩混合10min。用磁分離架吸附磁珠，棄上清；
? 加入800μl 洗滌液I 洗滌磁珠，吸附磁珠，棄上清；
? 再次加入800μl洗滌液I 洗滌磁珠，吸附磁珠，棄上清；
? 加入800μl 洗滌液II 洗滌磁珠，吸附磁珠，棄上清；
? 再次加入800μl 洗滌液II 洗滌磁珠，吸附磁珠,棄上清后靜置3-6min，去除乙醇殘留；
? 加入 100μl Nuclease-Free Water，混和均勻后洗脫5min；
? 吸附磁珠，回收含基因組DNA的洗脫液至另一離心管，進行DNA檢測及后續實驗。
QIAamp DNA Mini Kit按照說明書進行并改進，具體步驟如下：
? 在沉淀中加入180μl ATL和20μl 蛋白酶K，振蕩混勻。將離心管置于金屬浴或空氣搖床中，56°C振蕩2h；
? 從金屬浴或空氣搖床中取出離心管，進行短暫離心。在離心管中加入200μl AL，振蕩混勻；
? 離心管置于金屬浴中，70°C 振蕩10min，將離心管短暫離心；
? 在離心管中加入200μl 新鮮的無水乙醇，振蕩混勻，短暫離心；
? 將離心管中的液體全部轉入到Qiagen柱中。8000rpm離心1min，棄去廢液，保留柱子；
? 將柱子轉入到一個新的廢液收集管中，加AW1 500μl。8000rpm離心1min，棄去廢液，保留柱子；
? 將柱子轉入到一個新的廢液收集管，加AW2 500μl。13000rpm離心3min, 棄去廢液，保留柱子；
? 將柱子轉入到一個新的廢液收集管中，最高轉速離心1min。將柱子轉入到一個新的1.5ml離心管，在生物安全柜中打開蓋，晾2min；
? 在柱子中加入100μl buffer AE，蓋蓋放置5min。8000rpm離心1min，收集洗脫出的液體（含目標DNA）；
? 將收集的含DNA液體重新加入柱子中，蓋上蓋子放置5min。8000rpm離心1min，收集DNA，棄去柱子；
? 將收集到的DNA分裝出2份，每份25μl。將提取到的DNA置-80℃冷凍保存。
4.結果
兩種核酸提取方法用于臨床標本檢測的比較
胃液標本35例（RUT+），分別用上述兩種提取方法抽提HP核酸模板，實驗反應體系及反應條件見上，熒光定量檢測結果如表1和圖1所示。比較兩種提取方法在測定HP特
異基因及內參基因的差別是否具有統計學意義，采用多元方差分析，Wilks’λ=0.96，F=0.73，P=0.49>0.05，結果表明兩種核酸提取方法在檢測HP特異基因及內參基因的效果相當，說明兩種提取方法在臨床標本中的檢測能力無顯著差別。
兩種核酸抽提方法，EmerTher的操作過程簡單、時間短，提取效率及臨床標本檢測能力與QIAGEN相當，在大規模臨床標本篩查時應優先選擇性價比高的提取方法。
目錄號 | 規格 | 適用機型 |
|---|---|---|
DE01001 | 20份 | 瓶裝，適用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自動移液工作站 |
DE01002 | 100份 | 瓶裝，適用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自動移液工作站 |
DE01003 | 500份 | 瓶裝，適用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自動移液工作站 |
DE0196A | 96份 | Thermo Scientific KingFisher等多種自動磁珠純化儀 |
DE0196B | 96份 | 醫脈賽、圓點、奧盛、天隆、天根等品牌多種純化機型 |
DE0160C | 60份 | Thermo Scientific KingFisher mL等多種自動磁珠純化儀 |
DE0196D | 96份 | Thermo Scientific KingFisher Flex等多種自動磁珠純化儀 |
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【手工提取步驟】
1. 溶解蛋白酶K：按標簽所示，吸取PK溶解液至蛋白酶K干粉中配制成蛋白酶K溶液20mg/ml，顛倒混勻數次讓蛋白酶K充分溶解；
2. 取200-300μl液體樣本放入2ml離心管中，加入20μl蛋白酶K溶液、700μl裂解吸附液、30μl磁珠；
3. 置于旋轉混和儀，充分混勻30min；
4. 用磁分離架吸附磁珠1min，棄上清液；
5. 加入800μl洗滌液I洗滌磁珠，將含磁珠的洗滌液轉移至另一干凈離心管中，顛倒混勻洗滌10min，吸附磁珠，棄上清液；
6. 加入800μl洗滌液I洗滌磁珠3min，吸附磁珠，棄上清液；
7. 加入800μl洗滌液II洗滌磁珠3min，吸附磁珠，棄上清液；
8. 再次加入800μl洗滌液II洗滌磁珠3min，吸附磁珠，棄上清液后靜置5min，去除乙醇殘留；
9. 加入100μl洗脫液，60℃混合洗脫10min；
10. 磁場吸附磁珠，回收含基因組DNA的洗脫液至另一離心管，用于后續檢測或-20°C儲存。
【自動化提取步驟（以32通道為例）】
1. DE0196B預裝板設置（96孔板深孔板，樣品量200μl，16通量）
2.從試劑盒中取出預封裝96深孔板，輕甩96深孔板使試劑及磁珠均集中到96深孔板底部。使用前小心撕去鋁箔封口膜，避免96深孔板振動，防止液體濺出（注意：室溫低于
15℃時，請在使用前將96孔板置于37℃預熱20min，以避免沉淀析出）；
3.在第1列、第7列中加入200μl樣本和20μl蛋白酶K溶液；
4.放置2個8道磁套；選擇附表所列的自動化提取程序，開始提??；客戶可按所使用的核算自動提取儀適當調整程序，如有問題，請聯系技術支持；
5.轉移第6列、第12列中含核酸的洗脫液，用于后續檢測或-20℃儲存。
| 次序 | 列號 | 程序 | 混合時間（sec.） | 磁吸時間（sec.） | 等待時間（sec.） | 體積（μL） | 混合速度 | 溫度（℃） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1 | 裂解 | 900 | 0 | 0 | 900 | 快 | 50 |
| 2 | 2 | 吸磁 | 30 | 20 | 0 | 800 | 中 | 室溫 |
| 3 | 1 | 結合 | 600 | 30 | 0 | 900 | 快 | 50 |
| 4 | 2 | 洗滌1 | 600 | 20 | 0 | 800 | 快 | 室溫 |
| 5 | 3 | 洗滌2 | 240 | 20 | 0 | 800 | 快 | 室溫 |
| 6 | 4 | 洗滌3 | 180 | 20 | 0 | 800 | 快 | 室溫 |
| 7 | 5 | 洗滌4 | 180 | 30 | 120 | 800 | 快 | 室溫 |
| 8 | 6 | 洗脫 | 420 | 60 | 0 | 150 | 快 | 70 |
| 9 | 4 | 移動磁場 | 30 | 0 | 0 | 800 | 快 | 室溫 |
1、血液樣本基因組DNA提取方法？
答：磁珠法全血樣本基因組DNA提取通常分為兩類：
一步裂解法：將全血樣本直接加入裂解結合液后上機提??；
兩步裂解法：將全血樣本與紅細胞裂解液混合，待紅細胞細胞膜破裂后，離心收集白細胞，加入裂解結合液后上機提取。
一步裂解法適應于各種血液，包括新鮮血液、凍存血液、去血漿血細胞等，通常血液處理量為10μl到300μl；
兩步裂解法適用于白細胞結構完整的新鮮血液，通過離心后可對毫升級血液中白細胞進行富集后提取，可獲得大量基因組DNA；因操作過程涉及裂解紅細胞及離心收集白細
胞，需注意保存樣本中血細胞結構完整，過程較為繁瑣。
2、在哪些情況下選擇血液作為分子診斷DNA的來源
采用非侵入性的唾液及拭子采樣可對遺傳信息進行普通遺傳分析，在下列情況下，推薦通過血液作為樣本做為核酸來源：
1）需去除外源核酸干擾的分析，如二代測序NGS等；
2）細胞內寄生等感染性疾病檢測；
3）白細胞、造血細胞及血小板基因及變異分析；
4）臨床個性化及靶向用藥分析；
5）其他適應的條件。
