適合于簡單快捷提取質粒,快速從培養細菌中獲得大量的質粒DNA,經過獨特的表面修飾的磁珠,結合核酸能力更強、洗脫更容易,使用水即可將核酸從磁珠洗脫下來;提取的DNA可直接用于PCR、酶切、測序、轉化等生物學實驗。
操作流程(示意圖):
磁珠法質粒DNA提取試劑盒在菌液樣本抽提質粒的應用實例見下。
目錄號 | 規格 | 適用機型 |
---|---|---|
DE08001 | 20份 | 瓶裝,適用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自動移液工作站 |
DE08002 | 100份 | 瓶裝,適用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自動移液工作站 |
DE08003 | 500份 | 瓶裝,適用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自動移液工作站 |
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【手工提取步驟】
1. 取1-5ml過夜培養的菌液加入離心管中,5000g離心1min;
2. 棄上清,收集菌體沉淀;
3. 在離心管中加入100μl溶液I和10μl RNaseA溶液,充分混勻,懸浮菌體沉淀;
4. 加入150μl溶液II,溫和上下顛倒混勻4-6次;
5. 向離心管中加入150μl溶液III,立即溫和地上下顛倒混勻4-6次(出現大量白色絮狀物),或用移液槍吸打混勻,直至溶液澄清,白色絮狀物完全析出(如需完全降解
RNA,建議靜置10min);
6. 15,000g離心5分鐘;
7. 將步驟6中所得的上清液轉移到另一離心管,加入25μl核酸提取磁珠、200μl 結合液,上下顛倒溫和混勻1-2min;
8. 用磁分離架吸附磁珠1min,棄上清;
9. 加入800μl 75%乙醇溶液洗滌磁珠兩次;
10. 吸附磁珠,棄上清后靜置5min,去除乙醇殘留;
11. 加入100μl洗脫液,置于室溫,混和均勻洗脫5min(56oC洗脫效果更佳);
12. 磁場吸附磁珠,回收含質粒DNA的洗脫液至另一干凈離心管內,進行DNA檢測及后續實驗。
1、未提出質?;蛸|粒得率較低,如何解決?
A. 大腸桿菌老化:涂布平板培養后,重新挑選新菌落進行液體培養。
B. 質??截悢档停河捎谑褂玫涂截悢递d體引起的質粒DNA提取量低,可更換具有相同功能的高拷貝數載體。
C. 菌體中無質粒:有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在,經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如,柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定,因此不要頻繁轉接,每次
接種時應接種單菌落。另外,檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
D. 堿裂解不充分:使用過多菌體培養液,會導致菌體裂解不充分,可減少菌體用量或增加溶液的用量。對低拷貝數質粒,提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液,可以有助
于增加質粒提取量和提高質粒質量。
E. 質粒未全部溶解 (尤其質粒較大時) :洗脫溶解質粒時,可適當加溫或延長溶解時間。
F. 乙醇殘留:洗滌液洗滌后應離心盡量去除殘留液體,再加入洗脫緩沖液。
2、 怎樣提取不同體積的菌液?
A.可以同比例調整試劑的用量達到提取不同體積的菌液的目的。
B.對于大體積菌液,建議使用強磁板,可以加速提取過程。